苯并（a）芘对大鼠睾丸支持细胞连接蛋白基因表达的影响  学位论文  

苯并(a)芘(B(a)P)是多环芳烃的代表物质,普遍存在于大气、土壤与水中。它主要来自于煤焦油,汽车尾气,各类有机物产生的烟雾,烧烤食物以及工业污水中。日常生活中接触B(a)P主要通过污染空气的吸入、吸烟以及饮食。 B(a)P具致癌性、神经毒性、免疫毒性和生殖毒性。以往关于B(a)P研究主要集中于致畸、致癌致突变等方面。近年来,生殖健康问题备受关注。B(a)P具有生殖毒性,它可以引起睾丸萎缩、精子数量及活动能力下降,减低曲细精管的重量以及减少睾酮水平。但是B(a)P的雄性生殖毒性机制仍不完全清楚。 睾丸连接蛋白对于构成血睾屏障以及精子发生所需的微环境所必需,睾丸细胞通过连接蛋白进行着信息和能量物质的交换,因此连接蛋白对睾丸细胞的增殖、成熟和分化等生理过程起着重要的调控作用。近年来,连接蛋白在外源化学物诱导的生殖毒性过程中的作用越来越受关注。然而在B(a)P的雄性生殖毒性机制中,B(a)P对连接蛋白的影响和机制尚不清楚。 本研究拟通过建立体外SD大鼠原代培养睾丸支持细胞的B(a)P染毒模型,探讨B(a)P对睾丸支持细胞连接蛋白基因表达的变化,分析可能的毒性机制,为B(a)P雄性生殖风险评估、危害控制和预防提供依据。 研究方法：对21天大鼠睾丸通过两步酶消化法分离得到睾丸支持细胞,通过形态、细胞活力和纯度鉴定,显示培养系细胞生长状态良好,存活率大于94%,支持细胞纯度大于95%。在此基础上,应用半定量PCR法测定了B(a)P(0,5,10和25μmol/L)6小时和12小时暴露对支持细胞连接蛋白mRNA表达的影响,应用酶标法测定了B(a)P染毒对caspase-3、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSHpx)的影响,并通过caspase-3抑制剂和抗氧化剂,分析了caspase-3及B(a)P诱导的氧化损伤对支持细胞连接蛋白mRNA表达的调控。 结果一B(a)P对支持细胞及连接蛋白mRNA表达的影响 形态学观察显示B(a)P暴露12小时后在25μmol/L可引起培养系细胞的形态变化,显示支持细胞变瘦长,细胞间隙扩大,精原细胞从支持细胞表面脱落聚集,出现细胞碎片。 染毒时间为6小时,发现细胞活力有下降趋势,但与对照组相比,差异没有统计学意义；染毒时间为12小时,随着染毒剂量的增加,细胞活力呈下降趋势,在浓度为25μmol/L时,细胞活力下降明显,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。 本次研究主要检测了紧密连接蛋白occludin和ZO-1,锚定连接蛋白N-cadherin以及缝隙连接蛋白connexin-43口connexin-26。PCR结果显示：在培养系暴露B(a)P6小时后,随着剂量的增加,连接蛋白mRNA表达呈下降趋势,在25μmol/L时connexin-43、connexin-26、occludin mRNA表达下降明显,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05)；而此剂量下ZO-1和N-cadherin mRNA表达与对照组相比,差异没有统计学意义。在培养系暴露B(a)P12小时后,随着剂量的增加,连接蛋白mRNA表达呈下降趋势,在10μmol/L时,connexin-43、connexin-26、occludin mRNA表达下降明显,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05)；在25μmol/L时ZO-1mRNA表达下降明显,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05);N-cadherinmRNA表达有下降趋势,但与对照组相比,差异没有统计学意义。以上结果提示了connexin-43、connexin-26、occludin mRNA表达可能更敏感于B(a)P的细胞活力。 结果二caspase-3可调节B(a)P诱导的支持细胞连接蛋白mRNA表达的变化 Caspase-3作为凋亡的中枢效应器,被认为是与凋亡最有关联的酶,在细胞凋亡的起始和进展中发挥着重要的作用。B(a)P暴露12小时后,随着剂量的增加,caspase-3的活性呈上升趋势,且在10μmol/L和25μmol/L剂量时,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。在培养系中加入B(a)P并同时加入caspase-3制剂之后,caspase-3抑制剂拮抗了B(a)P (10μmol/L和25μmol/L)所诱导的caspase-3活性上升,与未染毒B(a)P的对照组相比,差异无统计学意义。 加入B(a)P并同时加入caspase-3抑制剂之后,connexin-43、connexin-26、occludin和ZO-1的mRNA表达在10μmol/L和25μmol/L时诱导的下降受到拮抗,与未染毒B(a)P的对照组相比,差异无统计学意义。 结果三B(a)P诱导的氧化应激影响支持细胞连接蛋白的表达 培养系暴露B(a)P12小时后,随着剂量的增加,活性氧(ROS)水平也上升,MDA含量也上升,在B(a)P浓度为10μmol/L和25μmol/L时,ROS和MDA含量明显上升,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。随B(a)P染毒剂量的增加,抗氧化酶活性下降：在B(a)P浓度为25μmol/L时,SOD和GSHpx酶活性明显下降,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05)；在B(a)P浓度为10μmol/L和25μmol/L时,CAT酶活性明显下降,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。 加入番茄红素(lycopene)作为抗氧化剂后,番茄红素拮抗了B(a)P所诱导的ROS和MDA水平上升,B(a)P+番茄红素组和未加B(a)P对照组相比差异无统计学意义。同时番茄红素也拮抗了B(a)P染毒所诱导的抗氧化酶活性SOD、GSHpxCAT活性下降,B(a)P+番茄红素组和对照组相比差异无统计学意义。与此同时,番茄红素也拮抗了B(a)P所形成的连接蛋白connexin-43、connexin-26occludin和ZO-1的mRNA表达,和未加B(a)P的对照组相比,差异无统计学意义。这些结果提示抗氧化剂可以预防B(a)P对支持细胞连接蛋白表达的影响。 结果四联合暴露PCB169增强B(a)P对支持细胞的毒性及对连接蛋白表达的毒作用 联合暴露PCB169(5μmol/L)和B(a)P (5μmol/L、10μmol/L和25μmol/L)后,发现在B(a)P为25μmol/L时,细胞活力、MDA、connexin43和occludin mRNA表达等指标中,联合暴露诱导的细胞毒性高于单独暴露B(a)P组,与单独暴露组相比差异有统计学意义(P<0.05)；PCB169增强B(a)P形成的毒性作用。在其余各指标中,尽管PCB169有增强B(a)P毒效应的趋势,但联合暴露组和单独暴露组之间,差别无统计学意义。 结论 在原代培养的支持细胞中,B(a)P可引起支持细胞中连接蛋白基因mRNA表达的下降,支持细胞中连接蛋白可能是其毒作用的靶点。B(a)P可能通过其诱导的细胞内caspase-3活性以及氧化损伤降低连接蛋白基因的表达。