精子DNA碎片的临床意义：临床和实验研究  学位论文  

精子DNA碎片(sperm DNA fragmentation, SDF)已经成为反映男性生育能力的一个独立的生物学和临床指标。高SDF影响自然生育和宫腔内人工授精等体内受精方式的生育能力。但SDF对常规体外受精(in vitro fertilization, IVF)和单精子卵胞浆内注射术(intracytoplasmic sperm injection, ICSI)的临床结果和出生后代的影响仍未定论。而这一问题在目前IVF和ICSI广泛应用于精液异常的男性不育症的时代尤显重要,因为男性精液指标异常不育患者存在明显增高的SDF。本研究分三个部分：1、通过临床研究阐明SDF对IVF和ICSI的临床结果的影响；2、通过动物实验研究高SDF对ICSI小鼠子代的遗传学和表观遗传学影响,探讨SDF对ICSI后代影响的机制；3、探讨环境污染物邻苯二甲酸二-2-乙基己基酯(di-2-ethylhexyl phthalate, DEHP)对SDF的影响以及其产生生殖毒性的机制。第一部分精子DNA碎片对IVF和ICSI临床结果的影响回顾性分析了2009年4月至2012年12月期间在本生殖中心就诊的连续3350个首次IVF和ICSI周期。正常卵巢储备功能女性病人采取标准黄体期降调长方案(standard leuteal down regulation long regimen, LP)治疗,潜在卵巢储备功能下降的女性病人则采用短方案(short flare-up regimen, SP)。采用SP的具体条件是基础FSH>10 IU/L或基础窦卵泡数<6或年龄≥38岁。在病人进入周期前1-2个月,采用染色质扩散实验(sperm chromatin dispersion, SCD)对所有男性病人行精子DNA损伤程度检测。将所有病例分为LP/IVF、LP/ICSI、SP/IVF和SP/ICSI等4组,将SDF分析阈值分别定为20%、30%和40%。分析4组中SDF值与IVF或ICSI的受精率、卵裂率、早期胚胎质量、胚胎种植率(implantation rate, IR)、临床妊娠率(clinical pregnancy rate, CPR)和早期流产率等临床结果的关系。结果表明：在LP/IVF组,当SDF≥20%和≥30%时,IR显著下降,CPR也有下降趋势,但无统计学显著性意义；当SDF ≥40%时,早期流产率显著增加；不同SDF阈值时,高SDF组与低SDF组的受精率和早期胚胎质量均无显著性差异。在LP/ICSI组,高SDF组与低SDF组的各项临床结果均无显著差异。然而,在SP/IVF组和SP/ICSI组,当SDF阈值分别为20%,30%和40%时,各组高水平SDF与IVF和ICSI的IR和CPR均有显著的负相关；在SP/ICSI组,高SDF显著影响受精率及胚胎质量。研究结果表明：SDF影响IVF和ICSI的临床结果,在卵巢储备功能低下的病人中尤为显著；这提示卵子质量在SDF对IVF和ICSI的影响中发挥重要作用。第二部分 精子DNA碎片对子代遗传学和表观遗传学的影响辅助生殖技术(Assisted Reproductive Technology, ART)是解决低生育力夫妇生育问题的有效治疗手段,然而其安全性问题,特别是不育人群本身携带的遗传缺陷对子代遗传及表观遗传的影响鲜有深入研究。本研究旨在研究DNA损伤精子行ICSI获得的子代,通过应用转基因小鼠-Big Blue(?)这种公认的突变检测模型来探讨其遗传学和表观遗传学是否发生改变。实验以B6D2F, (C57BL/6×DBA/2)野生型小鼠和Big Blue(?)小鼠作为精子和卵子供体。将其精子反复冻融后获得DNA损伤精子,继而利用ICSI-ET技术获得子代。通过收集孕中期胚胎,提取全基因组DNA、回收及体外包装λ噬菌体、铺板展示、lacI突变体筛选、扩增测序等等,最终确定精子DNA损伤诱导子代基因组点突变的发生率。另一方面,通过对孕中期胚胎印记基因H19和Snrpn DMR甲基化状态进行研究,以期探讨精子DNA损伤是否引起表观遗传学上的变化。研究发现,以Big Blue(?)转基因小鼠为精子供体的胎鼠,检测突变的lacI基因位于亲代精子上那么子代基因组若发生突变则来源于父源性突变,结果显示,实验组突变率(1.45±0.34)×10-5显著高于对照组(1.03±0.09)×10-5的突变率水平(P=0.0049)；而以Big Blue(?)转基因小鼠为卵子供体的胎鼠,因为检测突变的lacI基因位于亲代卵子上,子代基因组若发生突变则来源于母源性突变,实验组突变率(1.64±0.22)×10-5显著高于对照组(0.98±0.12)×10-5的突变率水平(P=0.0008)。同时,印记基因H19和Snrpn DMR的甲基化水平也发生显著变化,其中H19异常高甲基化(实验组69.9%vs.对照组52.5%,P=0.0375),Snrpn异常低甲基化(实验组31.5%vs.对照组53.0%,P=0.0451)。本研究结果显示,精子DNA损伤将对子代遗传和表观遗传的稳定性产生重大风险,提示在ART诊疗过程中,配子自身携带的遗传缺陷对子代健康的影响应当引起广泛重视。第二部分 精子DNA碎片对子代遗传学和表观遗传学的影响辅助生殖技术(Assisted Reproductive Technology, ART)是解决低生育力夫妇生育问题的有效治疗手段,然而其安全性问题,特别是不育人群本身携带的遗传缺陷对子代遗传及表观遗传的影响鲜有深入研究。本研究旨在研究DNA损伤精子行ICSI获得的子代,通过应用转基因小鼠-Big Blue(?)这种公认的突变检测模型来探讨其遗传学和表观遗传学是否发生改变。实验以B6D2F, (C57BL/6×DBA/2)野生型小鼠和Big Blue(?)小鼠作为精子和卵子供体。将其精子反复冻融后获得DNA损伤精子,继而利用ICSI-ET技术获得子代。通过收集孕中期胚胎,提取全基因组DNA、回收及体外包装λ噬菌体、铺板展示、lacI突变体筛选、扩增测序等等,最终确定精子DNA损伤诱导子代基因组点突变的发生率。另一方面,通过对孕中期胚胎印记基因H19和Snrpn DMR甲基化状态进行研究,以期探讨精子DNA损伤是否引起表观遗传学上的变化。研究发现,以Big Blue(?)转基因小鼠为精子供体的胎鼠,检测突变的lacI基因位于亲代精子上那么子代基因组若发生突变则来源于父源性突变,结果显示,实验组突变率(1.45±0.34)×10-5显著高于对照组(1.03±0.09)×10-5的突变率水平(P=0.0049)；而以Big Blue(?)转基因小鼠为卵子供体的胎鼠,因为检测突变的lacI基因位于亲代卵子上,子代基因组若发生突变则来源于母源性突变,实验组突变率(1.64±0.22)×10-5显著高于对照组(0.98±0.12)×10-5的突变率水平(P=0.0008)。同时,印记基因H19和Snrpn DMR的甲基化水平也发生显著变化,其中H19异常高甲基化(实验组69.9%vs.对照组52.5%,P=0.0375),Snrpn异常低甲基化(实验组31.5%vs.对照组53.0%,P=0.0451)。本研究结果显示,精子DNA损伤将对子代遗传和表观遗传的稳定性产生重大风险,提示在ART诊疗过程中,配子自身携带的遗传缺陷对子代健康的影响应当引起广泛重视。第三部分邻苯二甲酸二-(2-乙基己基)酯对精子DNA损伤、体外受精及其胚胎发育潜能的影响邻苯二甲酸二-(2-乙基己基)酯(di-(2-ethylhcxyl)phthalate, DEHP)作为全球范围内严重的工业污染物,其生殖毒性作用越来越受到人们的关注。我们通过小鼠体外受精-胚胎培养系统研究低剂量DEHP (1 μg/ml)离体暴露对精子受精过程和胚胎发育潜能的影响。同时,借助Big Blue(?)转基因小鼠这种公认的突变检测系统,通过在体染毒(500 mg/kg/day)探讨DEHP对睾丸基因组突变率的影响。离体实验发现,与对照组相比,低剂量DEHP暴露(1 μg/ml,30min)能够显著影响受精率和后续的胚胎发育过程(P<0.05),移植胚胎的出生率也显著下降(P<0.05)。我们同时收集小鼠体内受精的受精卵和2-cell胚胎进行体外暴露培养实验(1 μg/ml),发现受精卵的后续发育显著受损而2-cell胚胎的发育潜能与对照组差异不大,提示低剂量DEHP离体暴露能够对受精过程和胚胎发育潜能产生显著影响,而其作用位点主要集中在受精过程和第一次卵裂阶段。在小鼠在体染毒实验中,4周的DEHP染毒能够显著增加睾丸基因组的突变率,约为对照组的3倍(P<0.05)。而对离体暴露和在体染毒的精子进行DNA损伤检测后发现,DEHP并未显著提高精子DNA损伤程度。总的来说,无论是离体暴露影响受精过程和胚胎发育潜能,还是在体染毒对睾丸基因组的致突变作用,DEHP对人类生殖健康都存在巨大威胁,而这种生殖毒性作用可能不是通过损伤精子DNA这一途径实现的。