结核病是全球发病率和死亡率最高的传染性疾病之一。结核分枝杆菌(是引起结核病的病原菌。世界卫生组织2011年的全球结核病控制调查报告表明,2011年全球约880万新发病例(850万-920万),有110万人死于结核病,并有35万病人死于TB-HIV共感染。结核分枝杆菌持续感染及耐多药菌株的出现和蔓延,是目前结核病研究面临的两个最大难题,故开发新型抗结核药物迫在眉睫。 结核分枝杆菌细胞壁合成途径中的某些独特成分和因子可以成为药物设计的潜在靶标。结核分枝杆菌海藻糖是构成细菌细胞壁糖脂的必要组成成分,而海藻糖磷酸磷酸酶(TPP)是海藻糖磷酸合成过程中的关键酶,而且由于在人和哺乳动物体内没有TPP的同源蛋白,因此TPP是非常具有价值的潜在的抗结核药物的重要靶标。 本实验室通过前期选取结核分枝杆菌海藻糖磷酸磷酸酶作为药物靶标,基于虚拟筛选得到了一系列在体外能有效抑制MTB活性的先导化合物。本研究选取其中一个小分子化合物E对其抗结核活性进行深入评价。检测了化合物E对结核分枝杆菌H37Ra株的最小抑菌浓度(MIC)为0.078μg/ml,对H37Rv株MIC为4μg/ml,对耻垢分枝杆菌MIC为12.5μg/ml,对海分枝杆菌MIC为50μg/ml,对偶然分枝杆菌MIC为32μg/ml,对鸟分枝杆菌MIC为32μg/ml,对堪萨斯分枝杆菌MIC为32μg/ml。化合物E对结核杆菌H37Ra菌株具有杀菌活性,最小杀菌浓度(MBC)为4MIC。相比培养六周的H37Ra,化合物E对生长活跃期的H37Ra有较好的杀菌作用。1MBC化合物E浓度作用于H37Ra菌株,第8天杀菌率可达100%。结核杆菌H37Ra菌株在化合物E亚抑制浓度(0.02ug/ml)作用下,生长曲线发生了明显的变化。与治疗结核一线药物异烟肼(INH)、利福平(RIF)协同作用实验表明化合物E与INH及RIF分别具有相加及协同作用。化合物E对THP-1细胞具有较低的细胞毒性,对巨噬细胞内的结核杆菌也具有一定的杀菌活性。化合物E对处于持留状态的结核分枝杆菌也具有一定的杀菌作用。且结核分枝杆菌对化合物E不易发生耐药。这些结果表明了化合物E具有良好的体外抗结核活性,为研发新型抗结核药物打下了坚实的基础。 同时为了验证前期海藻糖磷酸磷酸酶作为小分子化合物E作用靶点的假设,在本研究中表达并纯化了TPP蛋白。然后在体外通过等量滴定热微量仪(ITC)研究化合物E与TPP是否具有结合作用；通过酶学实验测定化合物E是否能有效抑制TPP的酶活性；构建过表达和低表达TPP蛋白的H37Ra菌株,观察与野生型H37Ra菌株相比化合物E对过表达和低表达TPP蛋白H37Ra菌株MIC值是否有所上升或下降。虽然结果表明TPP可能不是化合物E的主要靶点,但基于化合物E体外良好的抑菌表现及新的靶标寻找技术的不断出现,未来能够有所突破并具有广阔的前景。
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