螯合剂BPCBG对铀染毒大鼠的促排效果与跨肾细胞膜转运的机制研究  学位论文  

放射性核素铀作为核燃料和核武器的装料被广泛应用于核工业生产和军事领域,且自1991年海湾战争以来,贫铀还被制造成贫铀穿甲弹和装甲坦克等贫铀武器应用于战争中,而2011年日本福岛核电站事故的发生再次引发国际社会对放射性核素内污染危害人体健康的极大关注。实验研究已证实,铀进入体内后,主要蓄积于肾脏和骨骼等靶器官,早期引起急性肾损伤,严重的甚至导致肾衰竭,晚期还可诱发骨肿瘤。使用螯合剂加速铀自体内排出是治疗铀中毒最为有效的救治措施。目前国内外在临床上通常使用碳酸氢钠作为排铀药物治疗铀中毒,但需使机体达到轻度碱中毒水平才有效。DTPA-CaNa3是锕系核素(Pu、Am)促排治疗的首选药物,但对铀的促排疗效不理想,因此,科学家们一直致力于寻找新的高效低毒的铀促排螯合剂。 本研究对我们合成的新型邻苯二酚氨羧酸螯合剂BPCBG进行了促排铀的药效学研究,观察其对急性铀染毒大鼠促排的剂量-效应与时间-效应关系,以及对铀致肾损伤的保护作用；并首次探讨了螯合剂BPCBG跨人肾细胞转运的机制及其与保护铀致肾细胞损伤的关系,与DTPA-CaNa3的疗效相比较,旨在为今后研发新的高效低毒的铀促排药物提供启示。 第一部分：螯合剂BPCBG对急性铀染毒大鼠的促排效果及肾损伤的保护作用 目的探讨邻苯二酚氨羧酸螯合剂BPCBG对急性铀染毒大鼠排铀作用的量-效和时-效关系以及对铀致大鼠肾损伤的保护效果,初步观察其对小鼠的急性毒性作用。 方法SD雄性大鼠按体重随机分为正常对照组、铀染毒组、不同剂量BPCBG组和DTPA-CaNa3组。给药组大鼠于腹腔注射(ip)醋酸铀酰(100μg只)后立即分别肌肉注射(im)60μmol/kg、120μmol/kg和600μmol/kg BPCBG及120μmol/kg和600μmol/kg DTPA-CaNa3,或于注射醋酸铀酰前0.5h和2h、铀染毒后Oh、0.5h、1h及2h im120μmol/kg BPCBG,铀染毒组于ip醋酸铀酰后立即im等体积生理盐水,正常对照组仅im生理盐水。采用ICP-MS方法检测24h尿铀排出量和肾、骨中铀蓄积量。大鼠ip醋酸铀酰(500μg/只)后立即im600μmol/kg BPCBG或1200μmol/kg DTPA-CaNa3,48h后检测血清肌酐(SCR)与尿素氮(BUN)含量,取一侧肾脏做肾组织病理切片观察。清洁级昆明种小鼠按体重随机分组,雌雄各半,根据预实验结果和0.75等比级数选择2254mg/kg、1691mg/kg和1268mg/kg3个剂量的BPCBG,尾静脉一次性注射给药,连续观察14d,记录小鼠的一般状况、死亡情况、出现的症状及严重程度、持续时间等,采用Bliss法计算其LD50。 结果铀染毒后立即im不同剂量BPCBG(60μmol/kg、120μmol/kg和600μmol/kg)使24h尿铀排出量比铀染毒组增加37%～61%(P<0.05,P<0.001和P<0.001),’肾和骨铀蓄积量分别下降59%～69%(P<0.01,P<0.001和P<0.001)和14%～58%(P<0.05,P<0.001和P<0.001),随给药剂量增加促排效果明显提高；提前0.5h或延迟0.5h和1h给予BPCBG仍有较好的排铀效果,尿铀排出量明显增加(提前0.5h或延迟0.5h给药：P<0.001,P<0.01),肾铀蓄积量(P<0.001,P<0.001和P<0.001)和骨铀蓄积量明显下降(P<0.001,P<0.001和P<0.05),但排铀效果随铀染毒与给药间隔时间的延长而下降；BPCBG立即给药能明显减轻铀中毒致肾脏的病理损伤,使SCR及BUN含量降低至正常对照组水平,对铀致肾功能损伤具有明显的保护作用。120μmol/kg和600μmol/kg DTPA-CaNa3虽然能明显降低大鼠肾铀蓄积量(P<0.05和P<0.01),但未能显著增加尿铀排出量,骨铀蓄积量还有增加趋势,并且对铀致大鼠肾损伤无保护作用。小鼠一次性iv BPCBG的LD50为1748.7mg/kg。 结论BPCBG对急性铀中毒大鼠有良好的促排效果与肾脏保护作用,初步急性毒性试验结果表明其毒性较低,是一个很有希望的铀促排螯合剂。 第二部分：螯合剂BPCBG在人肾细胞中的转运机制及对铀致肾细胞损伤的保护作用 目的探讨含2个羧酸基团的邻苯二酚氨羧酸螯合剂BPCBG进入和排出肾小管细胞的途径及其进入细胞后对铀致肾细胞损伤的保护效应,与含5个羧酸基团的氨烷基螯合齐DTPA-CaNa3目比较。 方法采用稳定高表达有机阴离子转运蛋白1(hOAT1)或3(hOAT3)的人胚肾293(HEK293)细胞(hOAT1-HEK293细胞和hOAT3-HEK293细胞),分别以OAT1的荧光底物6-羧基荧光素(6-CF)和OAT3的荧光底物5-羧基荧光素(5-CF)为检测指标,观察50μM、100μM与1000μM BPCBG对hOAT1-HEK293细胞摄入6-CF、hOAT3-HEK293细胞摄入5-CF的抑制作用,以OATs标准抑制物丙磺舒为阳性对照。通过构建靶向沉默hOAT4基因的Lenti-shRNA慢病毒表达载体及空载体并感染HEK293细胞,建立hOAT4稳定敲低表达的细胞株和空载体细胞株,采用Western Blot法检测其hOAT4蛋白的表达。以hOAT3/hOAT4转入荧光底物5-CF为指标,BPCBG预处理hOAT4敲低表达的HEK293细胞以及空载体细胞24h后,检测细胞摄入5-CF的量,探索BPCBG的排出途径。采用HEK293细胞,观察BPCBG抑制hOAT3/hOAT4介导的5-CF摄取的浓度-效应和时间-效应,验证BPCBG的转入途径；以及采用醋酸铀酰(IC40=1.4mM)染毒HEK293细胞48h,观察对hOAT3/hOAT4介导的5-CF摄入的影响。为进一步观察BPCBG跨肾细胞膜转运与保护铀致肾细胞损伤的关系,将HEK293细胞分为同时加丙磺舒(1mM)处理和不加丙磺舒处理的以下各组：①空白对照组(不加醋酸铀酰和螯合剂),②铀染毒对照组(只加醋酸铀酰),③各螯合剂组：1.4mM醋酸铀酰染毒24h后,分别加入含不同浓度BPCBG的新鲜培养液继续培养24h,采用胞质分裂阻断法检测微核形成率,流式细胞仪法检测细胞凋亡。以上实验均以DTPA-CaNa3为螯合剂对照。 结果50μM、100μM与1000μM BPCBG均能显著抑制hOAT1-HEK293细胞由hOAT1介导的6-CF的摄入(P<0.001,P<0.001和P<0.001)和hOAT3-HEK293细胞由hOAT3介导的5-CF的摄入(P<0.05,P<0.001和P<0.001),随药物浓度的增加抑制作用明显增强,与丙磺舒的抑制效果相近,表明BPCBG是hOAT1及hOAT3的转入底物,且亲和力较高,可能通过其介导进入细胞；而DTPA-CaNa3虽然也能抑制5-CF的摄入,但随浓度增加抑制作用明显低于BPCBG (1000μM:P<0.05),且未能显著抑制6-CF的摄入,表明DTPA-CaNa3亦是hOAT3的底物,但对hOAT3的亲和力明显低于BPCBG,并且不是hOAT1的底物。BPCBG对HEK293细胞由hOAT3/hOAT4介导的5-CF摄取的实验结果进一步表明,50μM和100μM BPCBG与丙磺舒一样能显著抑制HEK293细胞对5-CF的摄入(P<0.001和P<0.001),且随BPCBG预处理时间的延长抑制作用也增强；但随浓度增加BPCBG的抑制作用明显强于DTPA-CaNa3(10μM:P<0.01再次表明BPCBG是hOAT3/hOAT4的转入底物,其对hOAT3/hOAT4的亲和力明显强于DTPA-CaNa3。BPCBG对敲低表达hOAT4的HEK293细胞摄入5-CF的实验结果表明,hOAT4敲低表达的HEK293细胞对hOAT3/hOAT4共同介导的5-CF的摄入率与空载体细胞相比未见明显下降,表明5-CF可能通过hOAT3的代偿功能而转入；而BPCBG预处理hOAT4敲低表达的HEK293细胞24h后,使5-CF的摄入率明显低于BPCBG预处理的空载体细胞(P<0.001),相应地BPCBG预处理空载体细胞24h后使5-CF的摄入率较未经BPCBG预处理的空载体细胞明显提高(P<0.001),表明BPCBG能进入肾细胞且进入胞内的BPCBG与胞外的5-CF通过hOAT4发生了交换,从而促进了5-CF的转入,BPCBG则通过hOAT4排出细胞。相比之下,DTPA-CaNa3预处理hOAT4敲低表达的HEK293细胞和空载体细胞均未明显影响它们对5-CF的摄入,表明DTPA-CaNa3由hOAT4介导的排出作用不明显。1.4mM醋酸铀酰染毒HEK293细胞48h后,对5-CF摄入并无影响,表明铀对细胞的损伤尚未影响膜转运蛋白的功能。因此,进入细胞的BPCBG显著降低了铀诱导的微核形成率(P<0.05)与凋亡率(P<0.05),而同时加入丙磺舒抑制BPCBG进入细胞时,则未能显示对铀致肾细胞损伤的保护作用。DTPA-CaNa3单独作用及与丙磺舒同时作用时均未能显著降低铀诱导的微核形成与细胞凋亡。 结论BPCBG通过hOAT1、hOAT3或hOAT3/hOAT4介导进入肾细胞,又由hOAT4介导排出细胞,从而发挥对铀致细胞损伤的保护作用；DTPA-CaNa3因仅能通过hOAT3或hOAT3/hOAT4介导进入细胞,且对hOAT3或hOAT3/hOAT4的亲和力明显低于BPCBG,因而进入细胞的量明显低于BPCBG,且未能通过hOAT4泵出,可能是其对铀致肾细胞损伤无明显保护作用的原因之一。由此表明,由hOAT1、hOAT3或hOAT3/hOAT4介导的羧酸类螯合剂在肾细胞中的转运效率可能随其羧酸基团数量的增加而下降。