表皮葡萄球菌icaA~+/BF~-菌株生物膜调控基因的研究  学位论文  

表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis, SE)是条件致病菌,通常寄居在体表和粘膜表面,一般不致病。但它可通过合成细胞间多糖黏附因子(PIA,polysaccharide intercellular adhesin)等分子,粘附于医学材料表面(如人工晶体、心脏瓣膜等),相互粘连形成生物膜,将表皮葡萄球菌菌体包被于其中。生物膜是一种粘附于非生物或生物表面的微生物细胞菌落,它含有诸如蛋白质、多糖、核酸、脂和磷脂等生物大分子物质及细菌分泌的大分子多聚物及代谢产物等物质。生物膜可使宿主的淋巴细胞无法附着于植入材料表面,抑制宿主的局部免疫反应,引发感染。近年来,随着医疗植入材料的广泛应用,由表皮葡萄球菌生物膜引起的慢性医院内感染越来越被重视。 表皮葡萄球菌生物膜的形成主要分为两个阶段,即初始黏附和聚集。在初始黏附中,自溶素蛋白AtlE、Bap (Biofilm-associated protein)蛋白等起到重要作用；而在聚集阶段,细胞间多糖粘附因子(PIA)发挥着关键的作用。PIA由icaADBC基因簇编码的产物合成,因此,ica操纵子在表皮葡萄球菌生物膜形成过程中扮演了至关重要的角色。 细菌生物膜是一个非常复杂的群体生存环境,在生物膜内的细菌存在复杂的基因调控通路。目前,针对该方面的研究较为有限,且主要集中在实验室标准菌株,针对临床菌株生物膜调控影响因素的研究很少。双组分信号转导系统(Two-component Signal Transduction Systems, TCSs)在细菌适应生存环境变化中起到重要的作用,同时它还可调控细菌毒力及生物膜的形成。本论文首先对表皮葡萄球菌icaA+/BF-临床菌株的表型,生物膜调控基因的转录及蛋白的表达进行了研究；同时对实验室前期构建的双组分信号转导系统arlS基因突变株中,胞外多聚物(Extracellular polymeric substance, EPSs)的表达,生物膜调控基因的转录及蛋白质表达变化进行了研究,以期阐明表皮葡萄球菌生物膜形成的分子机制。 第一部分表皮葡萄球菌icaA+/BF-(?)临床菌株生物膜调控基因转录的研究 表皮葡萄球菌生物膜的形成过程包括：单个细菌黏附到材料表面,细菌间聚集,逐步形成多细胞层结构。研究表明,在上述两个阶段中,有诸多生物膜形成相关基因参与其中,如在粘附阶段,atlE和sdrF等发挥重要的作用,而在细菌聚集阶段,aap、icaADBC和bap等起主要作用。聚集相关蛋白(Aap)介导的细菌间相互粘附聚集在生物膜形成中发挥了极为关键的作用,它可通过自身结构域的变化产生同源二聚化,进而促进细菌间的相互聚集。细胞间多糖黏附素(Polysaccharide Intercellular Adhesin,PIA)是表皮葡萄球菌生物膜的主要成分之一,PIA的合成主要依赖icaADBC基因编码的产物IcaA,该产物具有N-乙酰葡萄糖基转移酶活性。通常认为icaADBC的存在与生物膜形成直接相关,但在本实验室前期的研究中,发现了15株临床菌株存在icaADBC(icaA低转录)但不形成生物膜(SE icaA+/BF临床菌株),提示在15株表皮葡萄球菌临床菌株中,可能存在其他因素调控或影响了icaADBC的转录。因此,我们对细菌的表型(生长曲线和粘附聚集能力),生物膜形成相关胞外粘附因子(PIA和Aap)的表达及生物膜相关基因(sarA,rsbU,srrA,arlRS和luxS)的转录调控进行了研究。 我们首先采用微量板半定量方法、PCR及RT-qPCR对SE icaA+/BF临床菌株进行了验证,确证该15株临床分离株均不形成生物膜,存在icaA但icaA基因转录水平均明显低于RP62A.SE icaA+/BF临床菌株的生长情况研究结果显示,该15株细菌的生长曲线与RP62A无明显差异。利用麦胚凝集素(WGA-HRP)检测发现在该15株SE icaA+/BF-I临床菌株中均无PIA,而在阳性对照组RP62A培养物中检测到PIA,阴性对照组ATCC12228培养物中未检测到PIA。 大量分泌至细菌表面和胞外的粘附分子如Aap蛋白对细菌间的相互粘附聚集和生物膜的形成起到非常重要的作用。细菌初始黏附实验检测了ica+/BF临床菌株黏附到96孔板(聚苯乙烯)表面的能力。结果表明SE ica+/BF-I临床菌株起始粘附能力与RP62A无明显差异,但细菌间聚集能力低于RP62A.Holger Rohde报道胰蛋白酶(trypsin)可以诱导生物膜形成阴性的临床菌株形成生物膜。因此,在细菌培养2～3 hrs后,加入trypsin并继续培养至6 hrs,检测trypsin对SE icaA+/BF-临床菌株生物膜形成及细菌起始粘附聚集能力的影响。结果显示,经trypsin处理后,15株临床菌株中有4株细菌生物膜形成能力增强,同时这4株细菌细胞间聚集能力增强。由于在上述实验中发现icaA+/BF临床菌株细菌间聚集能力明显弱于RP62A,因此采用RT-qPCR检测了其aap基因的转录水平。结果显示,在细菌生长生长4 hrs,15株icaA+/BF-I临床菌株中有4株细菌(26.7%)aap基因的转录水平高于RP62A,有8株细菌(53.3%)aap基因的转录水平低于RP62A,3株细菌(20%)aap基因的转录水平与RP62A相比无明显差异,而利用小鼠抗-Aap单克隆抗体进行Western blot检测结果显示：15株SE ica+/BF-临床菌株的Aap表达量明显低于RP62A。 我们对SE icaA+/BF-(?)(?)临床菌株生长4 hrs和10 hrs生物膜调控基因arlRS, rsbU, sarA,srrA和luxS的转录进行了研究。结果显示,4 hrs时,15株SE ica+/BF-临床菌株中有4株细菌(26.7%)的sarA基因的转录水平低于RP62A,其余11株细菌(73.3%)的sarA基因的转录水平与RP62A无明显差异。15株SE icaA+BF-临床菌株的rsbU基因,arlRS基因转录水平皆明显低于RP62A。15株SEica+/BF临床菌株中有10株细菌(66.7%)的srrA基因的转录水平低于RP62A,而其余5株细菌(33.3%)的srrA基因的转录水平与RP62A无明显差异。6株细菌(40.0%)的luxS基因的转录水平低于RP62A,其余9株细菌(60.0%)的luxS基因的转录水平与RP62A无明显差异,而在10 hrs,15株SE icaA+/BF-临床菌株中,有2株细菌(13.3%)的sarA基因转录水平高于RP62A,2株细菌(13.3%)的sarA基因转录水平低于RP62A,其余11株(73.4%)的sarA基因的转录水平与RP62A无明显差异。14株临床菌株的rsbU基因转录水平均明显低于RP62A。11株(73.3%)细菌的arlS基因转录水平低于RP62A,其余菌株的arlS基因的转录水平与RP62A无明显差异。12株(80.0%)arlR基因的转录水平低于RP62A,其余菌株的arlR基因的转录水平与RP62A无明显差异。4株细菌(26.7%)的srrA基因的转录水平低于RP62A,10株细菌(66.7%)的srrA基因的转录水平高于RP62A。1株细菌(6%)的luxS基因的转录水平高于RP62A,2株细菌(13.3%)的luxS基因转录水平低于RP62A。其余12株细菌(80.0%)的luxS基因的转录水平与RP62A无明显差异。实验结果显示,SE icaA+/BF临床菌株中,arlRS基因与细菌生物膜表型正相关,提示atlRs基因转录水平降低可能是导致15株SEicaA+/BF临床菌株ica操纵子低转录的主要作用因素之一(表1)。 表1表皮葡萄球菌ica+/BF-临床菌株生物膜调控基因转录水平差异统计 *represents for the numbers of biofilm formation related genes with at least a 2-fold difference by detecting the Ct value. 第二部分表皮葡萄球菌arlRS对细菌EPSs及相关蛋白合成的调控 双组分信号转导系统(TCSs)在细菌适应生存环境变化中起到重要的作用。有研究表明,在金黄色葡萄球菌中,ArlR可作为是全局调控因子,直接或间接调控多个基因的转录,进而影响生物膜的形成及毒力因子的表达。然而,ArlRSTCS在表皮葡萄球菌的调控作用尚不清楚。第一部分的研究发现,在ica操纵子低转录的15株SE icaA+/BF临床菌株中,arlRS基因在细菌生长4 hrs时转录水平明显下调,在10 hrs, arlRS基因的转录水平也明显低于RP62A。在实验室前期的研究中发现,表皮葡萄球菌arlS基因敲除后,细菌不形成生物膜,自溶能力增强,同时EMSA实验发现双组分信号转导系统arlRS的效应蛋白ArlR可以与ica操纵子结合,提示arlRS基因可能对ica操纵子存在调控作用,并在表皮葡萄球菌生物膜形成中发挥重要作用。 为了进一步研究arlRS基因对表皮葡萄球菌生物膜形成相关因素的调控作用,我们对SE 1457株arlS基因敲除突变株(SE1457△arlS)的胞外多聚物(PIA和eDNA)的表达,调控生物膜形成的基因转录水平(arlRS, rsbU, sarA, srrA和luxS)及蛋白质表达的差异(2-DE)进行了研究。首先,提取SE 1457△arlS株和SE1457野生株培养物中的胞外DNA,根据表皮葡萄球菌RP62A株基因组序列设计用于检测eDNA的基因(gyrA, lysA, serp0306和leuA)特异性引物,然后利用real-time PCR检测SE 1457△arlS株和SE1457野生株eDNA的释放量。结果显示,在SE 1457△arlS株中, gyrA, lysA, serp0306和leuA的表达水平与SE 1457相比无明显差异,表明SE 1457△arlS株eDNA的释放量与SE1457野生株无明显差异。利用WGA-HRP检测细菌培养物中PIA的量,结果在SE 1457△arlS中未能检测到PIA。进而采用RT-qPCR检测了SE 1457△arlS中ica操纵子的转录水平。结果显示,与SE1457野生株相比,SE 1457△arlS中icaA基因转录水平下调了约98%,明显低于SE1457野生株。进一步检测了SE 1457△arlS中生物膜相关调控基因的转录水平,发现arlS基因缺失后,与SE1457野生株相比,SE1457△arlS中的sarA和rsbU基因转录水平下调了约70%～80%,而luxS基因的转录水平则无明显变化。 最后,我们采用2-DE比较了SE1457野生株和SE 1457△arlS突变株的差异蛋白的表达,发现与SE1457野生株相比,SE 1457△arlS中63个蛋白质的表达量降低,58个蛋白的表达量增加。其中,与细菌细胞间聚集相关的蛋白Aap在1457△arlS中表达量明显下降,实验结果经Western blot方法验证。同时RT-qPCR方法检测结果显示,细菌生长至4 hrs时,与SE1457野生株相比,aap基因的转录水平下调了约70%,明显低于SE1457野生株。上述结果提示arlRS基因既可作用于ica依赖性途径,亦可作用于ica非依赖性途径影响生物膜的形成。因此,在表皮葡萄球菌中,arlRS基因能够调控诸多生物膜形成相关基因的转录及蛋白质的表达,因而在细菌整个调控网络中起到至关重要的作用。