帕金森氏病(Parkinson disease PD)是神经系统常见的变行性疾病之一.主要的病理改变是黑质纹状体通路的多巴胺能神经元变性,导致多巴胺合成减少和乙酰胆碱系统功能亢进.原发性PD的病因与发病机制至今尚不明了.PD患者中存在后天获得性细胞代谢紊乱的现象,提示胰岛素及其信号传导通路障碍.该文旨在通过MPP<'+>诱导PC12细胞凋亡建立体外PD模型,进而阐明胰岛是否可以发挥其抗凋亡作用及探讨此可能机制.第一部分 胰岛素可以抵抗MPP<'+>诱导的PC12细胞的凋亡应用二甲基噻唑二苯基四唑溴盐(MTT)法,观察PC12细胞暴露于不同浓度、不同时间MPP<'+>及胰岛素预先干预后再暴露于MPP<'+>后细胞生存率的改变.提示PC12细胞生存状态与MPP<'+>的浓度和时间呈反向变化趋势;胰岛素可以有效保护300μM MPP<'+>12小时内对PC12细胞的毒性损伤.第二部分 胰岛素受体磷酸化增加可抵抗 MPP<'+>诱导的PC12细胞的凋亡在前一部分实验的基础上,应用半定量逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)测定胰岛素受体(insulin receptor IR)mRNA的基因表达,应用免疫沉淀Western印迹分析技术测定胰岛素受体的蛋白表达,两者均未发生明显变化.应用胰岛素受体自身磷酸化的特异阻断剂-HNMPA-AM3再次进行MTT法对细胞生存率的检测实验.观察预加该试剂后,再预加不同浓度的胰岛素及MPP<'+>后细胞生存率的改变,几乎等同于未加胰岛素干预组.结果表明IR磷酸化可能是胰岛素抗MPP<'+>细胞毒的中心环节之一.此可能是胰岛素抵抗MPP<'+>诱导的PC12细胞的凋亡机制之关键.第三部分 磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B是胰岛素受体后信号传导通路控制PC12细胞凋亡的有效途径之一为了明确磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinostol3'-OH kinase,PI-3-K)/蛋白激酶B(protein kinase B,PKB)是否参与了胰岛素(INS)-INS受体介导的抵抗MPP<'+>诱导的PC12细胞的凋亡作用,该实验选择Wortmannin——PI-3-K的特异性阻断剂抑制PI-3-K的活性.观察应用此试剂后PC12细胞生存率的变化.结果表明:一旦PI3K的激酶活性被阻断,胰岛素的保护作用则基本消失.结论:1.在50~1000μM浓度范围内MPP<'+>浓度越大,对PC12细胞的毒性作用越大.处在同一浓度(300μM)的MPP<'+>中的PC12细胞时间越长(4小时~24小时),损害越多.10~100nM胰岛素可以抵抗300μM MPP<'+>12小时内诱导的PC12细胞的凋亡.2.以上不同实验条件下,胰岛素受体mRNA的基因表达水平、蛋白表达水平无明显变化.胰岛素受体自身酪氨酸磷酸化抑制剂——HNMPA-AM3可以阻断胰岛素的抗凋亡作用.过表达胰岛素受体的细胞株抗凋亡作用进一步增加.胰岛素受体自身酪氨酸磷酸化增加是胰岛素抗MPP<'+>诱导的PC12细胞凋亡的关键.3.PI-3-K的特异性阻断剂——Wortmannin 可以部分阻断胰岛素的保护作用.不同实验条件下,PKB的Ser<'473>磷酸化程度发生明显改变.磷酸化的PKB是胰岛素抵抗MPP<'+> 诱导的PC12细胞凋亡的主要抗凋亡分子.
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